Cum să Gram Stain (cu imagini)

Cuprins:

Cum să Gram Stain (cu imagini)
Cum să Gram Stain (cu imagini)

Video: Cum să Gram Stain (cu imagini)

Video: Cum să Gram Stain (cu imagini)
Video: Cum Sa Desenezi Un TELEFON (IPHONE) | Usor Pas cu Pas Tutorial pentru Incepatori 2024, Martie
Anonim

Colorarea Gram este o procedură rapidă utilizată pentru a căuta prezența bacteriilor în probele de țesut și pentru a caracteriza bacteriile ca fiind Gram-pozitive sau Gram-negative, pe baza proprietăților chimice și fizice ale pereților celulari. Pata Gram trebuie făcută aproape întotdeauna ca primul pas în diagnosticul unei infecții bacteriene.

Pata Gram este numită după omul de știință danez Hans Christian Gram (1853 - 1938), care a dezvoltat tehnica în 1882 și a publicat-o în 1884 ca o tehnică de discriminare între două tipuri de bacterii cu simptome clinice similare: Streptococcus pneumoniae (cunoscut și ca pneumococul) și bacteriile Klebsiella pneumoniae.

Pași

Partea 1 din 3: Pregătirea unei pete Gram

Gram Stain Pasul 1
Gram Stain Pasul 1

Pasul 1. Pregătiți-vă pentru lucrările de laborator

Puneți mănuși și legați părul lung pentru a preveni contaminarea probei de bacterii pe care o veți testa. Dezinfectați un spațiu de lucru sub capotă sau într-o altă zonă bine ventilată. Verificați dacă arzătorul Bunsen și microscopul sunt funcționale înainte de a începe.

Gram Stain Pasul 2
Gram Stain Pasul 2

Pasul 2. Sterilizați o lamă de microscop de sticlă

Dacă lamela de sticlă este murdară, spălați-o în apă cu săpun pentru a îndepărta grăsimea și murdăria. Dezinfectați lamela cu etanol, produs de curățat geamuri sau orice metodă recomandată de laboratorul dumneavoastră.

Gram Stain Pasul 3
Gram Stain Pasul 3

Pasul 3. Adăugați proba la diapozitiv

Puteți utiliza metoda de colorare Gram pentru a ajuta la identificarea bacteriilor prezente în probele medicale sau a culturilor bacteriene cultivate într-o cutie Petri. Pentru ca pata Gram să fie utilă, adăugați un subţire strat al probei pe pată. Se recomandă o probă sub 24 de ore, deoarece bacteriile mai vechi pot avea pereții celulari deteriorați, care răspund mai puțin previzibil la colorarea gramului.

  • Dacă utilizați o probă de țesut, adăugați 1-2 picături pe lamela de sticlă. Răspândiți-l uniform pe lamelă pentru a forma un frotiu subțire, folosind marginea unei a doua lamele de sticlă sterilizate. Lăsați-l să se usuce la aer înainte de a continua.
  • Dacă luați bacterii dintr-o cutie Petri, sterilizați o buclă de inoculare într-o flacără a arzătorului Bunsen până când luminează, apoi lăsați-o să se răcească. Folosiți-l pentru a plasa o picătură de apă sterilă pe lamă, apoi sterilizați și răcoriți bucla din nou înainte de a transfera o mostră mică de bacterii și de a amesteca ușor în apă.
  • Bacteriile din bulion trebuie amestecate într-un vortex, apoi adăugate cu o buclă de inoculare ca mai sus, fără a adăuga apă suplimentară.
  • Dacă aveți o probă de tampon, rulați tamponul ușor peste diapozitiv.
Gram Stain Pasul 4
Gram Stain Pasul 4

Pasul 4. Fixați frotiul pe căldură

Căldura va fixa bacteriile pe lamă, astfel încât acestea să nu fie la fel de ușor de clătite în timpul petei. Treceți rapid lamela de două până la trei ori printr-o flacără a arzătorului Bunsen sau încălziți-o deasupra unui dispozitiv de încălzire electric. Nu supraîncălziți sau probele pot deveni distorsionate. Dacă utilizați un arzător Bunsen, flacăra ar trebui să fie un con mic, albastru, nu unul portocaliu înalt.

Alternativ, frotiul poate fi fixat prin metanol în schimb, adăugând 1-2 picături de metanol pe frotiul uscat, drenând excesul de metanol și lăsându-l să se usuce la aer. Această metodă minimizează deteriorarea celulelor gazdă, oferind un fundal mai curat

Gram Stain Pasul 5
Gram Stain Pasul 5

Pasul 5. Poziționați diapozitivul pe o tavă de colorare

O tavă de colorare este un vas de mică adâncime din metal, sticlă sau plastic, cu o plasă mică sau un suport de sârmă care traversează partea superioară. Așezați diapozitivul deasupra acestui suport, astfel încât lichidele pe care le veți folosi se pot scurge în tavă.

Dacă nu aveți o tavă de colorare, diapozitivul poate fi așezat direct deasupra unei tăvi de plastic pentru cuburi de gheață

Partea 2 din 3: Efectuarea Gram Stain

Gram Stain Pasul 6
Gram Stain Pasul 6

Pasul 1. Inundați frotiul cu cristal violet

Utilizați o pipetă pentru a inunda proba de bacterii cu câteva picături de colorant violet cristal, uneori numit violet gentiană. Așteptați treizeci până la șaizeci de secunde. Violetul de cristal (CV) se disociază în soluții apoase în ioni CV + și clorură (Cl–). Acești ioni pătrund prin peretele celular și membrana celulară a celulelor gram-pozitive și gram-negative. Ionul CV + interacționează cu componentele încărcate negativ ale celulelor bacteriene pentru a colora celulele în violet.

Multe laboratoare folosesc cristalul violet „Hucker”, care adaugă oxalat de amoniu pentru a preveni precipitațiile

Gram Stain Pasul 7
Gram Stain Pasul 7

Pasul 2. Clătiți ușor cristalul violet

Înclinați diapozitivul și folosiți o sticlă de spălare pentru a stropi un mic jet de apă distilată sau de la robinet peste partea superioară a diapozitivului. Apa ar trebui să curgă peste suprafața frotiului, dar să nu fie îndreptată direct către ea. Nu clătiți excesiv, ceea ce ar putea îndepărta pata de bacterii Gram pozitive.

Gram Stain Pasul 8
Gram Stain Pasul 8

Pasul 3. Inundați frotiul cu iod, apoi clătiți

Folosiți o pipetă pentru a acoperi frotiul cu iod. Lăsați-l să stea cel puțin 60 de secunde, apoi clătiți cu aceeași metodă atentă. Iodul, sub formă de ioni încărcați negativ, interacționează cu CV + pentru a forma complexe mari de cristal violet și iod (complexe CV – I) în straturile interioare și exterioare ale celulei. Acest lucru va prinde culoarea violet cristal violet din celulă, oriunde a patat.

Iodul este coroziv. Evitați inhalarea, ingestia sau contactul cu pielea

Gram Stain Pasul 9
Gram Stain Pasul 9

Pasul 4. Adăugați un decolorant, apoi clătiți rapid

Pentru această etapă critică se folosește de obicei un amestec 1: 1 de acetonă și etanol, care trebuie temporizat cu atenție. Țineți diapozitivul unghiular, apoi adăugați decoloratorul până când nu se mai vede o culoare violetă în scurgerea de scurgere. Acest lucru durează de obicei sub 10 secunde, sau chiar mai puțin timp dacă decolorantul conține concentrații mai mari de acetonă. Opriți-vă imediat, sau decolorantul va îndepărta pata de cristal violet atât din celulele gram-pozitive, cât și din celulele negative, iar pata va trebui repetată. Clătiți imediat excesul de decolorare, folosind tehnica anterioară.

  • În schimb, poate fi utilizată acetonă pură (95% +). Cu cât este mai multă acetonă, cu atât decolorizorul va funcționa mai repede, necesitând o sincronizare mai precisă.
  • Dacă întâmpinați probleme la sincronizarea acestui pas, luați în considerare adăugarea decolorizantului picătură cu picătură.
Gram Stain Pasul 10
Gram Stain Pasul 10

Pasul 5. Inundați frotiul cu contra-pată, apoi clătiți

O contra-pată, de obicei safranină sau fucsină, este utilizată pentru a adăuga un contrast suplimentar între bacteriile gram-negative și gram-pozitive, prin colorarea bacteriilor decolorate (gram-negative) roz sau roșu. Lăsați-l să acționeze cel puțin 45 de secunde, apoi clătiți-l.

Fuchsin va colora mai intens multe bacterii gram-negative, cum ar fi haemophilus spp și legionella spp. Acest lucru îl poate face o opțiune mai bună pentru începători

Gram Stain Pasul 11
Gram Stain Pasul 11

Pasul 6. Uscați lamela

Puteți permite lama să se usuce la aer sau să o șteargă folosind hârtie bibuloasă vândută în acest scop. Pata Gram este completă.

Partea 3 din 3: Examinarea rezultatului

Gram Stain Pasul 12
Gram Stain Pasul 12

Pasul 1. Pregătiți microscopul cu lumină

Așezați diapozitivul sub microscopul cu lumină. Bacteriile variază foarte mult în dimensiune, astfel încât mărirea totală necesară va varia de la 400x la 1000x. La capătul superior al acestor măriri, se recomandă un obiectiv obiectiv cu imersie în ulei pentru o mai mare claritate. Așezați o picătură de ulei de imersie pe lamelă, evitând mișcarea în timpul aplicării pentru a preveni bulele. Mutați turela microscopului astfel încât obiectivul obiectiv să se fixeze în poziție, atingând uleiul.

Imersiunea în ulei poate fi utilizată numai pe lentile special concepute, nu pe lentile „uscate”

Gram Stain Pasul 13
Gram Stain Pasul 13

Pasul 2. Identificați bacteriile gram-pozitive și gram-negative

Examinați lamela sub microscopul cu lumină. Bacteriile gram-pozitive apar purpurii, datorită violetului cristal prins în pereții lor celulari groși. Bacteriile gram-negative apar roz sau roșu, deoarece violeta s-a spălat prin pereții celulari subțiri, apoi a pătruns în ei contracolorul roz.

  • Dacă eșantionul este prea gros, este posibil să vedeți rezultate fals pozitive. Colorați un nou eșantion dacă toate tipurile de bacterii sunt gram-pozitive, pentru a vă asigura că rezultatul este corect.
  • Dacă decolorantul a funcționat prea mult, este posibil să vedeți rezultate negative negative. Colorați un nou eșantion dacă toate tipurile de bacterii sunt gram-negative, pentru a vă verifica rezultatele.
Gram Stain Pasul 14
Gram Stain Pasul 14

Pasul 3. Căutați imagini de referință

Dacă nu sunteți sigur ce este o bacterie, căutați într-o colecție de imagini de referință, sortate după formă și rezultatul petei de gram. Puteți găsi baze de date online la baza de date națională a agenților patogeni microbieni și la multe alte site-uri. Pentru a face identificarea mai ușoară, exemplele comune sau importante din punct de vedere diagnostic sunt sortate mai jos după starea și forma gramului.

Gram Stain Pasul 15
Gram Stain Pasul 15

Pasul 4. Identificați bacteriile gram-pozitive după formă

Bacteriile sunt clasificate în continuare după forma lor la microscop, cel mai frecvent sub formă de coci (sferici) sau tije (cilindrice). Iată câteva bacterii gram-pozitive (colorate în violet) comune, organizate după formă:

  • Cocci gram-pozitivi sunt în general fie Stafilococi (adică coci în grupuri), fie Streptococi (adică coci în lanțuri).
  • Tije gram-pozitive includ Bacillus, Clostridium, Corynebacterium și Listeria. Actinomyces spp. tijele au adesea ramuri sau filamente.
Gram Stain Pasul 16
Gram Stain Pasul 16

Pasul 5. Identificați bacteriile gram-negative

Bacteriile gram-negative (colorate în roz) sunt adesea clasificate în trei grupe. Cocii sunt bacterii sferice, tijele sunt bacterii lungi și subțiri, iar tijele coccoide sunt undeva între ele.

  • Cocci gram-negativi sunt cel mai frecvent Neisseria spp.
  • Tije gram-negative includ E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas și mulți alții. Vibrio cholerae poate apărea ca tije obișnuite sau tije curbate.
  • Lansete "coccoide" gram-negative (sau "coccobacili") includ Bordetella, Brucella, Haemophilus și Pasteurella.
Gram Stain Pasul 17
Gram Stain Pasul 17

Pasul 6. Evaluează rezultatele mixte

Unele bacterii sunt dificil de colorat cu precizie, datorită fragilității sau ceară a pereților celulari. Acestea pot avea un amestec de pete purpurii sau roz în aceeași celulă sau între celule diferite în același frotiu. Orice probă de bacterii de peste 24 de ore poate avea această problemă, dar unele specii sunt dificil de colorat la orice vârstă. Acestea pot necesita teste mai specializate pentru a restrânge identificarea, cum ar fi o pată acidă rapidă, observarea creșterii culturii, culturi medii STI sau teste genetice.

  • Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium și Propionibacterium spp. sunt toate considerate bacterii gram-pozitive, dar apar adesea colorate neconcludent.
  • Bacterii mici și subțiri, cum ar fi Treponema, Chlamydia și Rickettsia spp. sunt dificil de colorat în mod corespunzător.
Gram Stain Pasul 18
Gram Stain Pasul 18

Pasul 7. Eliminați materialele

Procedurile de eliminare a deșeurilor variază între laboratoare și în funcție de materialele utilizate. De obicei, lichidul din tava de colorare este eliminat în sticle sigilate ca deșeuri periculoase. Înmuiați diapozitivele într-o soluție de înălbitor de 10%, apoi aruncați-le în containere ascuțite.

sfaturi

  • Amintiți-vă că randamentul pentru pata Gram este la fel de bun ca specimenul. Este important să învățați pacienții să furnizeze specimene bune (de exemplu, diferența dintre un scuipat și o tuse profundă pentru probele de spută).
  • Ca decolorant, etanolul acționează mai lent decât acetonă.
  • Respectați precauțiile standard de laborator.
  • Folosiți un tampon pentru obraz pentru practică, deoarece proba ar trebui să conțină atât bacterii gram-pozitive, cât și bacterii gram-negative. Dacă vedeți doar un tip sau altul, probabil că utilizați prea puțin sau prea mult decolorant.
  • Puteți folosi o știft de lemn tip arc cu arc pentru a prinde alunecarea.

Avertizări

  • Acetona și etanolul sunt inflamabile. Acetona va elimina uleiurile din mâini, determinând pielea să absoarbă mai ușor alte substanțe chimice. Purtați mănuși și utilizați cu precauție.
  • Nu lăsați frotiul să se usuce înainte de a clăti pata sau contracurarea.

Recomandat: